Los factores de transcripción NAC ATAF1 y ANAC055 afectan la respuesta al estrés por calor en Arabidopsis

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 11264 (2022) Citar este artículo

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La exposición previa (cebado) de las plantas a temperaturas elevadas suaves y no letales mejora su tolerancia a un estrés posterior por temperaturas más altas (estímulo desencadenante), que es de gran importancia ecológica. La 'termomemoria' mantiene esta tolerancia durante un período prolongado de tiempo. Las proteínas NAM/ATAF1/2/CUC2 (NAC) son factores de transcripción (TF) específicos de plantas que modulan las respuestas al estrés abiótico, incluido el estrés por calor (HS). Aquí, investigamos el papel potencial de los NAC para la termomemoria. Determinamos la expresión de 104 genes NAC de Arabidopsis después de cebar y desencadenar estímulos de calor, y descubrimos que la expresión de ATAF1 se induce fuertemente justo después del cebado y luego disminuye por debajo de los niveles de control durante la termorrecuperación. Los mutantes knockout de ATAF1 muestran mejor termomemoria que los de tipo salvaje, lo que revela un papel regulador negativo. Los análisis de expresión diferencial de los datos de RNA-seq de plantas sobreexpresadoras de ATAF1, mutantes de ataf1 y de tipo salvaje después del cebado con calor revelaron cinco genes que podrían ser objetivos directos asociados con el cebado de ATAF1: AT2G31260 (ATG9), AT2G41640 (GT61), AT3G44990 (XTH31) , AT4G27720 y AT3G23540. Con base en los análisis de coexpresión aplicados a los perfiles de RNA-seq antes mencionados, identificamos que ANAC055 está corregulado transcripcionalmente con ATAF1. Al igual que ataf1, los mutantes anac055 muestran una termomemoria mejorada, lo que revela un posible control conjunto de ambos NAC TF sobre la termomemoria. Nuestros datos revelan una importancia central de dos factores de transcripción NAC, ATAF1 y ANAC055, para la termomemoria.

Las temperaturas superiores a los umbrales de adaptación de las plantas provocan estrés por calor (HS), lo que disminuye su crecimiento, supervivencia y productividad. Las plantas, por naturaleza, tienen la capacidad de tolerar un cierto grado de temperatura elevada por encima de su temperatura ambiente. Esto se conoce como 'termotolerancia basal'. Además de la termotolerancia basal, las plantas también tienen la capacidad de adquirir termotolerancia si se exponen previamente a temperaturas más altas leves no letales, en un proceso llamado "cebado térmico"1,2,3,4. Este cebado por calor induce no solo una respuesta inmediata, sino que también conduce a cambios moleculares y metabólicos que persisten durante algún tiempo en ausencia del estrés y que permiten que las plantas respondan de manera más efectiva a un segundo evento de HS. El segundo estrés se conoce como el 'estímulo desencadenante'3,4. El período de tiempo entre el estímulo y la activación de los estímulos se denomina "fase de memoria", durante la cual la memoria de estrés puede formarse y consolidarse. La termomemoria se refiere al mantenimiento de algunos, pero no todos, los cambios inducidos por HS, que 'prepara' o prepara a las plantas para responder más rápida y fuertemente si dicho estrés se repite antes de que la memoria se desvanezca. La evidencia experimental indica que la termomemoria puede variar desde varias horas hasta días4,5,6 o incluso generaciones7. La termomemoria parece estar regulada, al menos en parte, por un conjunto de genes diferentes a los que actúan en la termotolerancia basal y la termotolerancia adquirida1,4,5,8,9,10,11.

El cebado con HS implica la activación de factores de transcripción de choque térmico (HSF) que inducen la expresión de proteínas de choque térmico (HSP) que ayudan a proteger las proteínas celulares de la desnaturalización y contribuyen a la reparación o eliminación de proteínas mal plegadas12,13. Se ha demostrado que varios HSF están involucrados en la respuesta del HS9,14,15,16. En particular, los HSFA1 de clase se consideran "reguladores maestros" de la respuesta HS16, ya que regulan la expresión de varios otros genes del factor de transcripción (TF), incluida la PROTEÍNA DE UNIÓN DE ELEMENTOS RESPONSABLES A LA DESHIDRATACIÓN 2A (DREB2A), HSFA2, HSFA7a, HSFB y PUENTE MULTIPROTEÍNICO FACTOR 1C (MBF1C)17. Si bien las respuestas inmediatas a HS están relativamente bien estudiadas, los procesos moleculares y fisiológicos que subyacen a la termomemoria en las plantas aún no se comprenden bien. Uno de los posibles mecanismos implica la acumulación de TF en su estado inactivo después de un estímulo de cebado (durante la fase de memoria) y su activación al experimentar el estímulo desencadenante18,19. Por ejemplo, el factor de choque térmico A2 (HSFA2) se ha identificado como un componente clave en el establecimiento de la termomemoria en plantas cebadas9. HSFA2 induce la expresión de HEAT STRESS-ASSOCIATED 32 (HSA32), que se encontró que se requiere específicamente para el mantenimiento de la termomemoria y para participar en el mantenimiento de la homeostasis celular durante el estrés por alta temperatura8.

NAM/ATAF1/2/CUC2 (NAC) es una familia de TF específicos de plantas que tienen un papel importante en la respuesta a diferentes estreses bióticos y abióticos, incluido el déficit hídrico, el estrés por salinidad y el estrés por temperatura20,21,22. Se ha informado que varios NAC están involucrados en la respuesta de HS basal en Arabidopsis thaliana y plantas de cultivo23,24,25,26,27. Por ejemplo, la sobreexpresión de ANAC019 mejoró la termotolerancia de Arabidopsis, presumiblemente al regular la expresión de HSFA1 y otros HSF, incluido HSFB25. También se ha encontrado que el gen NTL4 del factor de transcripción NAC asociado a la membrana de Arabidopsis responde al estrés por calor, y los mutantes ntl4 exhibieron una mayor viabilidad celular y menos acumulación de H2O2 que WT, bajo HS27. En el arroz (Oryza sativa), la expresión de SNAC3 es inducida por varios estreses, incluido el calor, y su sobreexpresión mejora la tolerancia a las altas temperaturas, la sequía y el estrés oxidativo26. La expresión del factor de transcripción TaNAC2L de Triticum aestivum (trigo) NAC también es inducida por la alta temperatura, y su sobreexpresión en Arabidopsis mejora su tolerancia al calor adquirida a través de la regulación de la expresión de sus genes relacionados con el estrés por calor23. Sin embargo, existe evidencia limitada sobre la participación de NAC TF en la regulación de la termomemoria. Arabidopsis JUNGBRUNNEN1 (JUB1) es el único NAC TF que hasta ahora se ha informado que regula la termomemoria. La expresión de JUB1 es inducida por HS y su patrón de expresión durante la fase de memoria es similar al patrón de expresión de otros genes asociados a la termomemoria, como HSFA224. La sobreexpresión de JUB1 mejora la termomemoria de las plántulas de Arabidopsis24.

En este estudio, nos propusimos identificar sistemáticamente NAC TF que respondan a la termomemoria en Arabidopsis. Analizamos los patrones de expresión de casi todos los (104) NAC de Arabidopsis después de cebar HS, durante la fase de termomemoria y después del estímulo desencadenante. Un NAC identificado en nuestra pantalla es ARABIDOPSIS TRANSCRIPTION ACTIVATOR FACTOR 1 (ATAF1; también llamado ANAC002). Se identificó previamente que ATAF1 estaba involucrado en las redes reguladoras de genes de senescencia, sequía y señalización de azúcar28,29,30,31. Descubrimos que la sobreexpresión de ATAF1 en plantas transgénicas de Arabidopsis limita la capacidad de la termomemoria, mientras que la eliminación de ATAF1 mejora profundamente la termomemoria y la supervivencia de las plantas expuestas a una HS más severa. Para identificar genes regulados por ATAF1 en termomemoria, empleamos RNA-seq para comparar las respuestas de calor en plantas de tipo salvaje y mutantes con niveles alterados de ATAF1 (sobreexpresadores y mutantes knockout). Descubrimos que ATAF1 se coexpresa con ANAC055. Con respecto a la termomemoria, el mutante doble ataf1/anac055 mostró un fenotipo similar al de los mutantes únicos ataf1 y anac055, lo que sugiere que los dos TF regulan la termomemoria de manera cooperativa.

Para investigar el patrón de expresión de NAC TF en respuesta al cebado con HS y durante la fase de memoria, tratamos las plántulas de Arabidopsis con un HS leve (cebado) antes de exponerlas a un HS severo (estímulo desencadenante). Recolectamos muestras en múltiples puntos de tiempo después del cebado (hasta 48 h en la fase de termomemoria) y probamos la expresión de 104 genes NAC; las plántulas mantenidas en condiciones no cebadas se usaron como controles (Fig. 1).

Expresión de factores de transcripción NAC durante la fase de memoria, después del cebado por calor. ( a ) Representación esquemática del régimen de estrés por calor (HS) aplicado a la memoria HS de los asnos. ( b ) Mapa de calor y agrupamiento de k-medias (k = 5 grupos) de NAC, en función de su cambio en la expresión (muestras de HS en comparación con controles no estresados) durante la fase de memoria en los puntos de tiempo indicados en la representación en (a). El color indica la relación de expresión como cambio log2-fold para los diferentes puntos de tiempo, donde 'amarillo' indica una expresión aumentada y 'púrpura' una expresión reducida. La lista de genes en cada grupo y sus valores de expresión se muestran en la Tabla complementaria S1.

Teniendo en cuenta un cambio de 1,5 veces como punto de corte, 75 de los NAC se expresaron de manera diferencial en el cebado en comparación con el control, mientras que la expresión de 29 genes NAC fue indetectable en las muestras de plántulas completas. El umbral de corte se eligió teniendo en cuenta que incluso cambios moderados en los niveles de expresión de TF pueden provocar fuertes respuestas aguas abajo32. La expresión de algunos NAC (incluidos, por ejemplo, ANAC013 y ANAC029/AtNAP) en respuesta al cebado con HS fue similar a la informada en un estudio anterior de Kilian et al.30. Los NAC se agruparon en grupos en función de su patrón de expresión utilizando el agrupamiento de k-means. Los cambios en la expresión de muchos NAC ya eran detectables inmediatamente después del tratamiento de cebado (Fig. 1, Tabla complementaria S1). Tres grupos que comprenden 33 genes en total (grupos 1, 2 y 3) aparecieron regulados al alza durante los puntos de tiempo tempranos y prácticamente sin cambios durante los puntos de tiempo posteriores (Fig. 1), mientras que 26 genes (en el grupo 4) inicialmente estaban fuertemente regulados a la baja y luego fuertemente regulados al alza durante puntos de tiempo posteriores (Fig. 1). Para los genes en el grupo 5, observamos una fuerte regulación a la baja en el punto de tiempo 0, que es inmediatamente después de completar los 90 minutos de HS, seguida de una fuerte regulación al alza en el marco de tiempo de hasta 2 h después de la HS, y luego un moderado a expresión sin cambios (Fig. 1). En conjunto, los NAC TF analizados exhibieron diferentes perfiles de expresión durante el cebado y la memoria de HS, lo que sugiere diferentes roles en la respuesta a HS.

La exposición previa de las plantas a un estrés moderado (cebado) altera su respuesta al estrés por temperatura severo que se avecina. Probamos esto, a nivel molecular, investigando la respuesta transcripcional de NAC TF. Probamos si el cebado por calor afecta o no la expresión de los NAC después del HS desencadenante. Con este fin, determinamos la expresión de NAC TF después del estímulo desencadenante (plantas T) y la comparamos con la expresión en plantas cebadas y desencadenadas (P + T), usando un corte de cambio de 1,5 veces. Para identificar patrones de expresión específicos entre las plantas P + T y T, se aplicó un enfoque de agrupamiento de k-medias, utilizando 10 grupos (Fig. 2, Tabla complementaria S2). Notamos que la expresión de la mayoría de los NAC TF se indujo en plantas cebadas + activadas, en comparación con plantas solo activadas. Solo unos pocos genes (grupo 9) mostraron un patrón de expresión opuesto, siendo mayormente reprimidos en plantas cebadas + activadas e inducidos en plantas solo activadas (Fig. 2). ATAF1 mostró un patrón particularmente interesante: su expresión permaneció casi sin cambios en las plantas después del cebado + disparo (P + T), y la expresión se indujo considerablemente en condiciones de solo disparo (sin cebado previo) (Fig. 2, grupo 9).

Expresión de NAC después de un estímulo desencadenante. ( a ) Representación esquemática de los puntos de tiempo utilizados para el análisis de expresión de NAC en plantas activadas (T) y en plantas que fueron preparadas antes de la activación (P + T). En plantas activadas (T), la expresión se calculó como una proporción de muestras HS en comparación con los controles no estresados. En plantas cebadas y disparadas (P + T), la expresión se calculó como cebadas y disparadas (P + T), en comparación con solo disparadas (T). ( b ) K-significa agrupamiento de perfiles de expresión de NAC de plantas preparadas y activadas (P + T) y activadas (T) después del estímulo desencadenante (k = 10 grupos). La expresión de genes en cada grupo se muestra como un mapa de calor. El color indica la expresión como un cambio log2-fold para los diferentes puntos de tiempo, donde el amarillo indica una expresión aumentada y el púrpura una expresión reducida. La lista de genes en cada grupo y sus valores de expresión se muestran en la Tabla complementaria S2.

Para probar la hipótesis de que ATAF1 participa funcionalmente en la termotolerancia, se realizaron experimentos fisiológicos adicionales en mutantes de ataf1 y plantas que sobreexpresan ATAF1. Se incluyeron otros dos genes de los grupos 4 (ANAC047/SHYG, AT3G04070) y 8 (ANAC013, AT1G32870) para comparar.

Para investigar el impacto de los genes NAC seleccionados en la termomemoria, evaluamos su participación funcional en el proceso analizando el fenotipo de los mutantes sobreexpresadores y knockout (o knockdown) en respuesta a un HS desencadenante administrado 3 días después del cebado con calor (3 días de termomemoria). ). Como se muestra en la figura complementaria S1, los sobreexpresadores ANAC013 y SHYG, las líneas de eliminación de shyg y eliminación de anac013 no fueron significativamente diferentes del tipo salvaje en comparación con el ensayo de termomemoria. Sin embargo, ATAF1 parecía estar involucrado en la termomemoria. Un análisis fenotípico de plantas transgénicas ATAF1 para la termomemoria mostró un fenotipo fuerte, donde los mutantes ataf1–2 y ataf1–4 tenían una tasa de supervivencia y una masa fresca significativamente más altas en comparación con las plantas WT, mientras que las plantas que sobreexpresaban ATAF1 (llamado ATAF1-OE en el siguiente ) exhibió una termomemoria severamente reducida (Fig. 3a-c). Cuando el mutante ataf1–4 se transformó con un alelo ATAF1 (pATAF1::ATAF1-GFP) que expresa una fusión ATAF1-GFP del promotor ATAF1 nativo, la termomemoria se restauró a la respuesta de tipo salvaje (Fig. S2 complementaria). En conjunto, estos resultados sugieren un papel regulador negativo de ATAF1 en la termomemoria.

Mejora de la termomemoria en mutantes ataf1. ( a ) Fenotipo de termomemoria de plantas transgénicas ATAF1. Las plántulas de ATAF1-OE, ataf1-2, ataf1–4 y WT se expusieron al régimen de HS que se muestra esquemáticamente en la Fig. 1a. Las fotos se tomaron 14 días después del segundo HS (estímulo desencadenante). Se muestra el fenotipo de una réplica representativa de al menos tres réplicas biológicas independientes. ( b, c ) Cuantificación de los resultados que se muestran en ( a ). (b) Porcentaje de plántulas en diferentes clases fenotípicas; el fenotipo de termotolerancia se clasificó en tres clases dependiendo del grado de recuperación de la planta. Las clases de fenotipo se ilustran en el panel (a). ( c ) Masa fresca de plántulas en plantas cebadas con HS y activadas en comparación con plantas de control sin estrés. Las barras de error representan la desviación estándar, calculada a partir de tres réplicas biológicas; cada réplica es la masa promedio de 13 plántulas. Las diferencias significativas entre plantas transgénicas y WT se calcularon utilizando la prueba t de Student; *indica valor P < 0,05.

Como nuestros datos sugirieron que ATAF1 es un regulador negativo de la termomemoria, buscamos comprender el papel de ATAF1 en respuesta a un estímulo de cebado de calor mediante la identificación de sus genes diana regulados. Con este fin, las plántulas mutantes WT, ATAF1-OE y ataf1–4 se trataron con el estímulo de cebado (37 °C durante 90 min), y luego se recolectaron muestras en tres puntos de tiempo (0 h, 1 h y 4 h; Fig. 4a) después del cebado térmico para el perfil de expresión génica por RNA-seq. Para eliminar la posible influencia de otros factores ambientales, se recolectaron muestras de control (control no cebado) en los mismos puntos de tiempo que las muestras tratadas térmicamente.

Agrupación de datos de RNA-seq. ( a ) Presentación esquemática de los puntos de tiempo utilizados para el análisis de expresión por RNA-seq. (b) Arriba: agrupación jerárquica de las muestras según sus patrones de expresión. "+" denota líneas ATAF1-OE; "0" denota Col-0 de tipo salvaje; y "-" denota ataf1–4. Los tamaños de los círculos indican el tiempo transcurrido desde HS (0, 1 y 4 h después del estrés por calor). Los colores negro y rojo indican si las plantas se sometieron a control o tratamiento térmico por 90 min. Leyenda: mapa de calor coloreado de los coeficientes de Pearson de los perfiles de expresión entre todos los pares posibles de las muestras. Un esquema de color de arco iris parcial, de rojo a azul, indica el rango de valores de correlación. ( c ) Gráfica de escalado multidimensional (MDS). Similitudes y diferencias generales entre muestras, basadas en un análisis de escalamiento multidimensional. Brevemente, la distancia euclidiana entre todas las muestras se calculó de acuerdo con los niveles de expresión de todos los genes y se representó en un espacio bidimensional.

Para comprender la relación entre las muestras en RNA-seq, se realizó un análisis de agrupamiento jerárquico y se estableció un mapa de calor de los coeficientes de correlación de Pearson de los perfiles de expresión entre todos los pares posibles de muestras (Fig. 4b). Observamos una agrupación entre réplicas biológicas, lo que sugiere una alta reproducibilidad del experimento. El mapa de calor también mostró una fuerte separación entre muestras según las condiciones de HS y por genotipo (Fig. 4b). Las similitudes y diferencias generales entre las muestras se confirmaron mediante la escala multidimensional (MDS) (Fig. 4c), lo que respalda una separación más fuerte por condición (celo y control) que por genotipo. También notamos una similitud de las muestras bajo control de temperatura y aquellas después de 4 h de estrés por calor, lo que sugiere una rápida recuperación de la mayoría de los cambios en la expresión génica. Es de destacar que la expresión de ATAF1 en plántulas WT durante la fase de memoria, según lo revelado por RNA-seq, siguió el patrón determinado por qRT-PCR (Fig. S3 complementaria).

Para los tres genotipos, encontramos la mayor cantidad de genes expresados diferencialmente (DEG) en el punto de tiempo 0, justo al final del tratamiento de cebado térmico de 90 minutos (Fig. 5a). Para identificar los genes asociados con el cebado de HS, usamos los mismos criterios que usaron previamente Sedaghatmehr et al.4. Investigamos genes cuya expresión se indujo después del cebado y se mantuvo alta en todos los puntos de tiempo examinados en la fase de memoria, así como genes cuya expresión se reguló a la baja y se mantuvo baja durante la fase de memoria (Fig. 5a). Entre los DEG se encuentran los HSP4 asociados a la termomemoria cuya expresión en respuesta al cebado por calor se indujo de manera similar en ATAF1-OE, ataf1–4 mutante y WT, como HSP22, HSP21, HSP17.4 y HSP18.2 (Tabla complementaria S3). Este hallazgo corrobora la conclusión de que estas HSP contribuyen a una respuesta térmica general, que es común a los tres genotipos.

Cambios transcriptómicos globales de genes asociados a la termomemoria potencialmente regulados por ATAF1. ( a ) Diagramas de Venn de genes inducidos por calor y reprimidos por calor, después del cebado por calor (calor en relación con el control) en plantas WT, mutantes ataf1–4 y transgénicas ATAF1-OE. ( b ) Diagrama de Venn de genes regulados al alza en ATAF1-OE y regulados a la baja en el mutante ataf1, y viceversa, en comparación con WT, en respuesta a un cebado HS, después de 0 h, 1 ho 4 h. ( c ) Representación esquemática de la posición de los sitios de unión de ATAF1 en las regiones aguas arriba de los genes identificados en ( b ).

Para identificar las respuestas diferenciales de plantas mutantes ATAF1-OE y ataf1–4 al cebado térmico, analizamos los datos de RNA-seq para genes regulados al alza en ATAF1-OE, en comparación con WT, pero regulados a la baja en plantas mutantes ataf1–4, y viceversa ( Figura 5b). A continuación, para identificar posibles genes diana directos de ATAF1, analizamos los promotores de genes expresados diferencialmente en busca de la presencia del sitio de unión de ATAF1 (informado por Garapati et al.31) o de la unión de ATAF1 según lo determinado por secuenciación de purificación por afinidad de ADN ( DAP-seq) experimentos33. El análisis se realizó para cada punto de tiempo después del cebado térmico (0 h, 1 h y 4 h). En total, identificamos 64 genes como posibles objetivos directos de ATAF1 (Tabla complementaria S4). Luego, refinamos nuestro análisis buscando esos posibles genes objetivo que comúnmente están regulados por ATAF1 en los tres o dos puntos de tiempo después del cebado con calor. Cinco genes, es decir, AT2G31260 (ATG9), AT2G41640 (GT61), AT3G44990 (XTH31), AT4G27720 y AT3G23540, se regularon comúnmente en dos de los tres puntos de tiempo, lo que sugiere que podrían ser objetivos directos asociados al cebado de ATAF1 (Fig. 5c); no se reguló ningún gen en los tres puntos temporales. ATG9 es un gen de autofagia34 y la evidencia experimental indica que la autofagia juega un papel en la respuesta al estrés por calor35,36. Su participación en la termomemoria aún no se ha confirmado. Los dos genes GT61 y XTH31 están relacionados con la biosíntesis y expansión de la pared celular. La glicosiltransferasa 61 (GT61) pertenece a la familia de las glicosiltransferasas (GT). Las proteínas GT tienen diversas funciones en las plantas, pero la mayoría de ellas probablemente estén involucradas en la biosíntesis de polisacáridos y glicoproteínas en la pared celular. En pastos, incluyendo el arroz (Oryza sativa) y el trigo (Triticum aestivum), las enzimas de la familia GT61 están involucradas en la síntesis de xilanos, uno de los principales componentes de la pared celular37,38,39. Todavía no se ha demostrado que GT61 participe en el cebado o la tolerancia al estrés por calor. XTH31 pertenece a la familia de xiloglucano endotransglucosilasa/hidrolasa (XTH). Generalmente, los miembros de la familia XTH están involucrados en la remodelación, expansión y morfogénesis de la pared celular, lo que sugiere un papel potencial en las respuestas al estrés40. En Arabidopsis, XTH31 participa en la regulación del contenido de xiloglucano de la pared celular41. El mutante con pérdida de función xth31 tiene una sensibilidad reducida a ABA y las semillas germinan más rápido que las del WT41,42. Las plantas de soja transgénica (Glycine max) que sobreexpresan XTH31 de Arabidopsis muestran una mayor tolerancia a las inundaciones junto con raíces más adventicias y raíces primarias más largas43. Los dos genes AT4G27720 y AT3G23540 no están bien caracterizados. AT4G27720 está anotado para codificar una proteína de la superfamilia facilitadora principal con una función de transportador de iones molibdato, mientras que AT3G23540 está anotado para codificar una proteína de la superfamilia alfa/beta-hidrolasa. Las enzimas α/β-hidrolasa están involucradas en varios procesos, incluyendo la biosíntesis, el metabolismo, la transducción de señales, la regulación génica44 y en la respuesta y tolerancia de las plantas al estrés por salinidad45.

Los genes con patrones de expresión similares a menudo comparten funciones similares y están potencialmente regulados por los mismos factores de transcripción. Con el fin de identificar los genes co-regulados con ATAF1 en respuesta al cebado por calor, se realizó un análisis de coexpresión utilizando los datos transcriptómicos de plantas ATAF1-OE, mutantes ataf1–4 y WT, bajo condiciones de control y tras la exposición al calor. Se utilizó un análisis de red de correlación ponderada para encontrar módulos de genes altamente correlacionados. Este método se usa comúnmente para investigar las relaciones entre genes y para identificar genes candidatos para análisis posteriores46. El análisis de coexpresión reveló 40 módulos en nuestro conjunto de datos (Fig. 6a). Estos módulos contenían grupos de genes expresados de manera similar. Es probable que los genes regulados directamente por ATAF1, en respuesta al calor, muestren patrones de expresión similares; por lo tanto, tomamos datos disponibles públicamente sobre genes que ya han sido identificados como potencialmente atacados por ATAF1 (en general, no solo por estrés por calor) y preguntamos si estos genes estaban presentes en nuestros módulos de coexpresión. Los datos disponibles públicamente de los posibles objetivos directos se generaron mediante un ensayo DAP-seq33. Los genes diana putativos se designaron por tener un pico DAP-seq dentro de los primeros 1000 pb corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción. Por lo tanto, comparamos la lista de genes que se proponen como objetivos directos de ATAF1 (de O'Malley et al.33) con los genes que se agrupan en el análisis de coexpresión; notamos que los objetivos potenciales de ATAF1 estaban sobrerrepresentados en los grupos de coexpresión 10 y 13 (Fig. 6b). Estos grupos necesitaban más investigación porque probablemente contenían genes objetivo directos de ATAF1, en respuesta al estrés por calor. Los grupos se interrogaron adicionalmente con los objetivos TF propuestos identificados mediante el ensayo DAP-seq desarrollado por O'Malley et al.33. Encontramos que tres de los grupos (10, 13, 21) mostraron un enriquecimiento significativo para los genes dirigidos tanto por ATAF1 como por ANAC055, lo que sugiere que los genes en estos grupos podrían estar co-regulados por los dos NAC (Fig. 6b).

Objetivos potenciales de ATAF1 en respuesta al estrés por calor. (a) El gráfico de barras muestra el número de genes en cada grupo de coexpresión. Se realizó un análisis de agrupamiento mediante análisis de red de correlación de genes ponderados, que dio como resultado 40 grupos de genes coexpresados juntos. ( b ) El gráfico de barras muestra la proporción de objetivos ATAF1 y ANAC055 en cada grupo, incluidos los genes objetivo de ambos; los grupos con un enriquecimiento significativo de los genes diana ATAF1 y ANAC055 están sombreados (P < < 0,001); solo dos grupos (10 y 13) están altamente enriquecidos con dianas ATAF1; los grupos 10 y 21 están significativamente enriquecidos para ANAC055, y los grupos 10, 13 y 21 están enriquecidos para genes que son el objetivo de ambos factores de transcripción.

Nuestro análisis de coexpresión mostró que ATAF1 y ANAC055 tenían una gran cantidad de objetivos coexpresados compartidos en respuesta a HS (Tabla complementaria S5). Por lo tanto, probamos si ANAC055 también está funcionalmente involucrado en la regulación de la termomemoria. Con este fin, evaluamos el fenotipo de termomemoria de líneas transgénicas con expresión alterada de ANAC055 (Fig. 7a, b). Se probaron dos mutantes anac055 (anac055-1 y anac055-2), y ambos mostraron un aumento sustancial en la relación de masa fresca, la supervivencia y el contenido de clorofila en comparación con WT, mientras que las plantas que sobreexpresaban ANAC055 mostraron una disminución en esos parámetros (Fig. 7b, Figura complementaria S4). Estos resultados indican un papel negativo de ANAC055 en la regulación de la termomemoria, similar al de ATAF1. Para probar si ATAF1 y ANAC055 funcionaron o no de manera total o parcialmente redundante, generamos un doble mutante ataf1/anac055 y expusimos plántulas a HS y comparamos sus fenotipos con los fenotipos de los correspondientes mutantes de un solo gen. La proporción de masa fresca del doble mutante ataf1/anac055 fue mayor que la del WT, pero no significativamente diferente de la de los mutantes knockout de un solo gen ataf1–4 y anac055-1 (Fig. 7c). Este resultado indica que ATAF1 y ANAC055 requieren la función del otro para controlar la termomemoria.

La termomemoria mejora en el mutante de doble knockout ataf1–4/anac055 en comparación con WT. (a) Representación esquemática del régimen del SA. ( b ) Fenotipo de termomemoria de mutantes ANAC055-OE, anac055-1 y anac055-2, y plantas WT. ( c ) Fenotipo de termomemoria de ATAF1-OE, ataf1–4 mutante, ataf1–4/anac055 doble mutante y plantas WT. Las plántulas se expusieron al régimen HS que se muestra en (a). Paneles de la izquierda: plántulas fotografiadas 14 días después de la exposición al estrés por calor desencadenante. Se muestra el fenotipo de una réplica representativa de al menos tres (b) o cinco (c) réplicas biológicas independientes. Paneles de la derecha: masa fresca de plántulas con estrés por calor, en comparación con plantas de control (sin estrés por calor). Las barras de error representan la desviación estándar, que se calculó a partir de tres réplicas biológicas, donde cada réplica era la masa promedio de 18 a 19 plántulas. Las diferencias significativas entre las líneas transgénicas y las plantas WT se calcularon utilizando la prueba t de Student; * si P < 0,05; *** si P < 0,001.

HS es uno de los principales estreses abióticos que afectan negativamente el crecimiento y la reproducción de las plantas a nivel mundial. El impacto de HS en la producción de cultivos aumenta con el cambio climático. La exposición previa a HS leve (cebado por calor) permite que las plantas adquieran y mantengan la tolerancia al HS al establecer una memoria celular de un HS anterior (termomemoria)1,2,3,4. Aquí, estudiamos el papel de los NAC TF en la termomemoria. Encontramos que varios NAC respondieron sustancialmente a su nivel de expresión después del estrés por calor y que los cambios en la expresión persistieron durante la fase de memoria. Estos hallazgos son similares a los informados para el patrón de expresión de otros genes asociados a la termomemoria durante la fase de memoria (como HSFA2, HSA32 y JUB1)8,9,24.

Luego analizamos la expresión de NAC TF después del estímulo desencadenante (segundo estrés por calor) para investigar si su expresión se vio afectada por un tratamiento de cebado. Nuestros datos muestran que la expresión de NAC se alteró después del estímulo desencadenante, lo que indica la presencia de memoria transcripcional que controla su expresión. Anteriormente se informó un patrón de expresión similar para la memoria de sequía, donde la expresión de un subconjunto de DEG se altera después de un segundo estrés por sequía. Ding et al.47 clasificaron los genes de la memoria en cuatro grupos distintos, cada uno mostrando diferentes patrones de expresión: genes con niveles de expresión aumentados (o disminuidos) después de un primer estrés, y un nivel aún mayor (o disminuido) después de un segundo estrés, que ellos , respectivamente, denotados como (+/+, o −/−); 'genes de memoria revisados' que se inducen después de un primer estrés y luego disminuyen después del segundo estrés (+/-), o lo contrario (-/+). Muchos NAC mostraron un patrón de expresión similar a los informados por Ding et al.47.

Descubrimos que la expresión de ATAF1 (ANAC002) aumenta rápidamente justo después del cebado HS y luego disminuye por debajo de los niveles de control durante la fase de memoria (Fig. 1; grupo 2). También encontramos que los mutantes knockout de ataf1 eran más tolerantes al estrés por calor que el tipo salvaje, lo que revela un papel regulador negativo de ATAF1 en la memoria HS. ATAF1 se identificó previamente como un importante regulador de la senescencia y la respuesta al estrés por sequía29,31,48. Está bien establecido que ATAF1 promueve la senescencia al regular directamente la expresión de dos TF involucrados en la senescencia y el mantenimiento del cloroplasto: ANAC092 (ORE1) y GOLDEN2-LIKE1 (GLK1)31. ATAF1 también regula la respuesta a la sequía al regular la expresión de 9-CIS-EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE 3 (NCED3), que codifica una enzima clave de la biosíntesis de ABA31,49.

Utilizamos el análisis RNA-seq para identificar cambios transcripcionales tempranos controlados por ATAF1. Se han identificado previamente varios mecanismos (genes) que están involucrados en la tolerancia al calor basal: incluyen la desintoxicación de ROS, la señalización de lípidos y la activación de proteínas de choque térmico y factores de choque térmico8,9,10,27,50. Nuestros datos encontraron respuestas similares en plantas ATAF1-OE, mutantes ataf1–4 y WT, donde estos mecanismos se activaron de manera similar.

El análisis de coexpresión se ha establecido como una poderosa herramienta para identificar genes diana de TF51,52. Por ejemplo, Jensen et al.49 realizaron un análisis de coexpresión en conjuntos de datos de micromatrices disponibles públicamente e identificaron 25 genes coexpresados con ATAF1. Las regiones promotoras de estos coexpresores de ATAF1 se enriquecieron significativamente en los sitios de unión de ATAF1. Realizamos un análisis de coexpresión y combinamos esta información con datos disponibles públicamente de un enfoque DAP-seq33. Descubrimos que cuatro grupos de coexpresión se enriquecieron con los genes diana ATAF1 predichos; y esos también fueron enriquecidos para genes diana de otro NAC TF, ANAC055. Encontramos muchos genes objetivo comúnmente regulados por ATAF1 y ANAC055, lo que sugiere una superposición al menos parcial entre los dos TF con respecto a su capacidad reguladora. A menudo, los TF actúan de manera redundante. Por ejemplo, los factores de transcripción WRKY11 y WRKY17 actúan como reguladores negativos de la resistencia básica a Pseudomonas syringae pv. tomate (Pst)50. La pérdida de función de WRKY11 aumenta la resistencia hacia Pst. Un análisis de expresión de genes seleccionados en mutantes simples y dobles reveló que ambos TF modulan los cambios transcripcionales en respuesta a la infección por patógenos; sin embargo, cada uno de ellos actuó de forma específica o parcialmente redundante, dependiendo del gen diana específico50. En nuestro trabajo, identificamos ATAF1 y ANAC055 como reguladores negativos de la termotolerancia. Los datos fenotípicos y de expresión génica de los mutantes simples y dobles ataf1 y anac055 mostraron una redundancia reguladora parcial entre ATAF1 y ANAC055.

Nuestros resultados sugieren que ATAF1 y ANAC055 funcionan como reguladores negativos de la termomemoria porque (i) los mutantes individuales ataf1 y anac055, así como las plantas doblemente mutantes, tienen un fenotipo similar en la termomemoria, (ii) parecen estar coexpresados, y (iii) sus posibles genes diana se superponen. Se necesitan más estudios de interacción de proteínas para probar si ATAF1 y ANAC055 también interactúan físicamente, por ejemplo, como heterodímeros o si solo están conectados a través de sus redes reguladoras de genes. Esta interacción debe investigarse en un contexto temporal y espacial para evaluar su relevancia para la termomemoria.

Recientemente se ha sugerido que el factor de transcripción inducible por calor HSFA2 está involucrado en la termomemoria, particularmente regulando los genes de memoria HS en el meristemo apical del brote (SAM), lo que sugiere que el establecimiento de la termomemoria involucra mecanismos específicos de órganos53,54. Nuestros resultados muestran que en las líneas ataf1–4, una mayor proporción de plantas mostró una recuperación completa, es decir, las plántulas y los cotiledones permanecieron verdes en comparación con las plantas WT. En las plantas que solo se recuperaron parcialmente, los cotiledones permanecieron blanqueados y las hojas verdaderas en desarrollo emergieron verdes (Fig. S4 complementaria). Las hojas verdes emergentes sugieren que los mecanismos que protegen el SAM, donde se desarrollan las hojas nuevas, juegan un papel en la termomemoria.

La mayor parte de la comprensión actual de la termotolerancia y el termocebado se basa en las plántulas de Arabidopsis. Sin embargo, se han realizado algunos estudios limitados para evaluar el termocebado en plantas de cultivo. Por ejemplo, el cebado térmico del trigo de invierno durante las etapas de elongación del tallo, espigado y antesis mejoró significativamente el rendimiento del grano bajo estrés por calor durante la fase de llenado del grano55. Otro mecanismo para mejorar la termotolerancia puede ser a través de endófitos de raíz que parecen mejorar la termotolerancia de los cultivos al afectar la expresión del gen asociado a la termomemoria HSFA256. Nuestro estudio muestra la importancia de dos genes, ATAF1 y ANAC055, como reguladores negativos de la termomemoria en plántulas; queda por probar si el crecimiento posterior o el rendimiento de la semilla también se modifican bajo HS recursivo. Al menos para las plántulas probadas aquí, no se observó una penalización de biomasa en condiciones sin estrés. Una vez que se establezca una mejor comprensión de la termomemoria en los organismos y cultivos modelo, la tecnología de edición del genoma podría emplearse para mejorar el rendimiento de los cultivos en el campo en condiciones climáticas futuras anticipadas.

El ecotipo Col-0 de Arabidopsis thaliana se utilizó como tipo salvaje y se obtuvo del European Arabidopsis Stock Centre (NASC) (http://arabidopsis.info/). Las semillas ATAF1-OE, ataf1-2 (SALK-057618) y ataf1–4 (GABI-Kat GK565H08) fueron descritas previamente en Garapati et al.31. Las semillas de las líneas de inserción de ADN-T de ANAC055 (anac055-1; SALK_014331 y anac055-2; SALK_011069) se obtuvieron de la colección de semillas del European Arabidopsis Stock Center (NASC) (http://arabidopsis.info/). Las líneas transgénicas ANAC047, es decir, ANAC047-OE (35S::ANAC047-GFP) y las dos líneas knockout (líneas de inserción de ADN-T shyg-1/SALK-066615 y shyg-2/GABI-Kat GK-343D11) fueron previamente descrito por Rauf et al.57. Las semillas de las líneas ANAC013-OE y knockdown (anac013-kd) fueron proporcionadas por el Prof. Frank van Breusegem (Universidad de Ghent, Ghent, Bélgica) y descritas en De Clercq et al.58.

Para 35S::ANAC055 (ANAC055-OE), el marco de lectura abierto de ANAC055 se amplificó mediante PCR a partir de ADNc de hoja de Arabidopsis Col-0 y se insertó en pUni/V5-His-TOPO (Invitrogen). A continuación, el ADNc se clonó mediante sitios PmeI-PacI añadidos en un vector de transformación de plantas pGreen0229-35S modificado59. El vector pGreen0229-35S::ANAC055 resultante se sometió a electroporación en la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens y se transformó en Arabidopsis de tipo salvaje mediante inmersión floral. Para construir pATAF1::ATAF1-GFP, se insertó un fragmento genómico que abarca el promotor ATAF1 de 1,5 kb y la región codificante de ATAF1 (sin el codón de parada de traducción) corriente arriba de la secuencia codificante de la proteína de fluorescencia verde (fusión en marco) en el plásmido pK7FWG2 ,060. La clonación reemplazó el promotor CaMV 35S presente en el plásmido con el promotor ATAF1. La línea de complementación knockout ataf1 se generó mediante la transformación del mutante ataf1–431 con la construcción pATAF1::ATAF1-GFP.

El mutante de doble knockout ataf1/anac055 se generó cruzando el mutante homocigoto ataf1–4 con el mutante homocigoto anac055-1. Las plantas de la generación F2 se examinaron mediante PCR para seleccionar plantas homocigóticas doblemente mutantes. La lista de cebadores utilizados para el genotipado se proporciona en la Tabla complementaria S6.

Las semillas de Arabidopsis se esterilizaron superficialmente lavándolas con etanol al 70 % durante 2 min; Luego, la solución de etanol se reemplazó con hipoclorito de sodio al 20 % y las semillas se incubaron en la solución durante 20 min, con agitación continua. Posteriormente, las semillas se lavaron cuatro veces con agua estéril y se dejaron secar sobre papel filtro esterilizado, en banco limpio laminar. Aproximadamente el mismo número de semillas (alrededor de 500 semillas) se germinaron en pequeñas placas de Petri que contenían medio Murashige y Skoog (MS) de potencia media suplementado con sacarosa al 1% (p/v). Para la estratificación, las placas se mantuvieron en cámara oscura (8 °C) durante 2 días antes de colocarlas en cámara de crecimiento (fotoperiodo 16 h/8 h: luz/oscuridad a 22,5 °C, bajo 120 μmol m−2 s− irradiancia de 1 fotón). Se utilizaron plántulas de cinco días de edad para los ensayos de HS.

Para el perfil de expresión de NAC, se expusieron plántulas de Arabidopsis de 5 días de edad a un régimen de HS. Las plantas se prepararon con estrés por calor leve a 37 °C durante 90 min en una cámara de crecimiento y, posteriormente, volvieron a su condición de crecimiento normal para recuperarse durante 2 días y evaluar su termomemoria. Luego, las plantas se desafiaron con un HS desencadenante de 44 °C durante 45 min. Las plántulas de Arabidopsis se recolectaron durante la fase de memoria y después del estímulo desencadenante, en los puntos de tiempo indicados en la Fig. 1. Las plántulas enteras recolectadas de una sola placa se consideraron como una réplica biológica. Se recogieron muestras de control (sin tratamiento) al mismo tiempo para reducir los efectos circadianos. Se analizaron tres réplicas biológicas por tratamiento, por punto de tiempo y por genotipo. Las muestras se congelaron directamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior análisis.

El contenido de Clorofila se midió utilizando el protocolo de Hiscox e Israelstam61. Las plántulas congeladas de diez se sumergieron en 0,5 ml de dimetilsulfóxido precalentado (DMSO, 65 °C) y se incubaron a 65 °C durante 20 min. Para la medición, el extracto se diluyó 1:10 o 1:100 con DMSO. Se registró la absorbancia a 663 nm y 645 nm, respectivamente, para la clorofila a y b. Se utilizó la siguiente fórmula62 para calcular la concentración de clorofila a, b y clorofila total como mg g−1 de masa fresca (FM):

Los datos se normalizaron al respectivo control de cada genotipo.

Para el perfil de expresión de los genes NAC, se extrajo el ARN total con Trizol (Ambion, Life Technologies), seguido de la purificación del ARN con columnas del kit PureLink RNA Mini (Ambion, Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN se midió utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific); El ADN genómico se digirió utilizando el kit TURBO DNA-free (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La ausencia de contaminación por ADN genómico se confirmó mediante qRT-PCR, utilizando cebadores específicos de intrones del gen de control AT5G65080 (para conocer las secuencias de los cebadores, consulte la Tabla complementaria S6). El ADNc se sintetizó a partir de 4 µg de ARN de alta calidad, utilizando el kit de síntesis de ADNc Revert Aid H Minus First Strand (Thermo Scientific), siguiendo las instrucciones del fabricante.

La reacción de qRT-PCR se realizó con la mezcla maestra SYBR Green (Applied Biosystems): ADNc 0,5 μL, mezcla maestra SYBR Green (2x) 2,5 μL, mezcla de cebadores directo e inverso (cada 0,5 μM) 2 μL. Las reacciones se incubaron en un sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7900 HT (Applied Biosystems) utilizando el siguiente protocolo: la temperatura se fijó primero a 95 °C y se mantuvo constante durante 10 min, y luego se sometió a una serie de 40 ciclos de 95 °C. durante 15 s y 60 °C durante 1 min. Se utilizó ACTIN2 (AT3G18780) como gen de referencia para el análisis de datos. La plataforma de cebadores de los 104 genes NAC TF de Arabidopsis se estableció utilizando la herramienta QuantPrime63. Las secuencias de cebadores se dan en la Tabla complementaria S6. Luego de 40 ciclos de reacción, se generó una curva de fusión aumentando la temperatura de 60 a 95 °C, con una velocidad de rampa de 1.9 °C min−1, para verificar la amplificación de los productos deseados. La eficiencia de la reacción se estimó utilizando el software LinRegPCR, según lo descrito por Caldana et al.64.

Los datos se analizaron utilizando el método Ct comparativo, como se describe en Kamranfar et al.65. Brevemente, el valor delta Ct (ΔCt) se calculó normalizando cada valor de Ct con el valor de Ct del gen de referencia ACTIN2. Luego, el nivel de expresión génica se expresó como la diferencia entre un valor arbitrario de 40 y el valor ΔCt (un valor alto de 40-ΔCt indica un nivel alto de expresión génica). Se usó un umbral de cambio de 1,5 veces para seleccionar genes expresados diferencialmente.

Para el análisis de RNA-seq, se utilizaron plántulas de Arabidopsis de 5 días de edad de los tres genotipos: WT, ataf1–4 mutante y ATAF1-OE. Después del tratamiento con la temperatura de cebado con calor (37 °C durante 90 min), las plántulas se cosecharon en los puntos de tiempo 0 h, 1 h y 4 h durante la fase de memoria.

Los transcriptomas de los tres genotipos WT, ataf1–4 y ATAF1-OE se analizaron mediante tecnología RNA-seq. El ARN total se aisló de plántulas de Arabidopsis de 5 días de edad de los tres genotipos. Las plántulas enteras recolectadas de cada placa (grupo de al menos 10 plántulas) se consideraron como una réplica biológica. Se utilizaron tres réplicas biológicas por tratamiento, por punto de tiempo y por genotipo, lo que hizo un total de 72 muestras. El ARN se aisló usando Direct-zol RNA MiniPrep Plus (Zymo Research, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad se evaluó con un Bioanalizador (Agilent Technologies, Waldbrann, Alemania) y la cantidad se determinó con Qubit (Invitrogen, Life Technologies). Se usó ARN de alta calidad (3 µg) para preparar bibliotecas para la secuenciación. Se prepararon bibliotecas de extremos emparejados (PE) de 150 pb de secuenciación de ARN a partir de muestras enriquecidas con ARNm, utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEB Next Ultra para secuenciación Illumina (New England Biolabs), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se agruparon un total de 12 muestras en un carril de la celda de flujo. El ARN se secuenció con una máquina Illumina HiSeq4000 en KAUST Core Labs.

HISAT se utilizó para alinear las lecturas de secuencias de ARN en el genoma de Arabidopsis thaliana (TAIR10)66. Solo se conservaron las lecturas de secuenciación que se mapearon de forma única en el genoma. Se utilizó Htseq-count para contar el número de lecturas de secuenciación de las transcripciones67. VOOM, un método de transformación que permite el uso de datos de RNA-seq para el marco del modelo lineal, se usó para calcular la abundancia de transcritos, y se usó la normalización de cuantiles para normalizar la distribución de abundancia entre muestras68. EdgeR y LIMMA69,70 se utilizaron como marco para calcular los genes expresados diferencialmente. R, un entorno estadístico general, se utilizó para la gestión de datos, análisis y generación de cifras71.

El contraste lineal personalizado se configuró para calcular la expresión diferencial entre genotipos o temperaturas. Más específicamente, los efectos de interacción de segundo orden se calcularon utilizando el marco de contraste70. Por ejemplo, se podría realizar un cálculo para evaluar cuantitativamente los cambios en la expresión génica bajo calor, en comparación con el control para ataf1 y WT: (heatataf1 − controlataf1) − (heatWT − controlWT). Todos los puntos de corte de significación estadística se ajustaron para pruebas múltiples mediante el control de la tasa de descubrimiento falso (Benjamini-Hochberg) en 0,0572 mediante "decideTests" (..., method = "global", adjust.method = "BH", p.value = " 0,05", lfc = 0.

Para todos los genes y muestras, se realizó un análisis de red de correlación de genes ponderados para identificar grupos de genes coexpresados46, utilizando parámetros predeterminados. El parámetro de potencia de umbral suave se estableció en 6, que es el valor, basado en un examen gráfico, que se cumplen las condiciones óptimas de la red (índice máximo de ajuste sin escala y conectividad media mínima). Para el escalado multidimensional, se utilizó la función cmscale en R.

Los sitios de unión del factor de transcripción (TFBS) adquiridos a través de DAP-seq según lo informado por O'Malley et al.33 se extrajeron de la base de datos de cistrome de plantas disponible públicamente. Los picos del motivo de unión a DAP-seq se extrajeron en formato de pico estrecho y se mapearon en el genoma de Arabidopsis. A continuación, se calculó la distancia desde la ubicación máxima hasta el sitio de inicio de la transcripción (TSS) más cercano a través del comando "más cercano" de bedtools73, donde las ubicaciones de TSS se tomaron del archivo de anotación TAIR 1074. Los genes diana putativos ATAF1 y ANAC055 se definieron por tener al menos un pico DAP-seq dentro de los primeros 1000 pb aguas arriba de los respectivos TSS. El análisis estadístico para el enriquecimiento de los genes objetivo dentro de los grupos de coexpresión se realizó en R, utilizando una prueba hipergeométrica para sobrerrepresentación71.

La investigación experimental y los estudios de campo sobre materiales vegetales cumplen con las directrices y leyes institucionales, nacionales e internacionales pertinentes.

Los datos de secuenciación de ARN están disponibles en la base de datos de NCBI Bioproject con ID SUB8978006 (https://ngdc.cncb.ac.cn/search/?dbId=gsa&q=SUB8978006). Todos los demás datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

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La investigación fue apoyada por fondos de la Universidad de Ciencia y Tecnología King Abdullah (KAUST), Arabia Saudita. NOA recibió apoyo a través de L'Oréal-UNESCO For Women in Science 2014 Middle East Fellowship. SMS recibió financiación del Ministerio de Ciencia, Investigación y Arte de Baden-Wurtemberg, Alemania (Az: 75533-30-20/1). BMR agradece a la Universidad de Potsdam, y SB agradece al Instituto Max Planck de Fisiología Molecular de Plantas por el apoyo financiero. BMR agradece al Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea, proyecto PlantaSYST (SGA-CSA No. 739582 bajo FPA No. 664620) por su financiación. TDW agradece a la Escuela Internacional de Investigación Max Planck 'Metabolismo primario y crecimiento vegetal', Potsdam, por el apoyo financiero. Los autores agradecen al Prof. Frank van Breusegem (Universidad de Gante, Gante, Bélgica) por proporcionar semillas de ANAC013-OE y líneas de eliminación (anac013-kd).

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Annapurna Devi Allu

Dirección actual: Departamento de Biología, Instituto Indio de Educación e Investigación Científica (IISER), Tirupati, India

Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad King Abdulaziz, Jeddah, Arabia Saudita

Nouf Owdah Alshareef

División de Ciencias e Ingeniería Biológicas y Ambientales (BESE), Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah (KAUST), Thuwal, Arabia Saudita

Nouf Owdah Alshareef, Yong H. Woo, Mark Tester y Sandra M. Schmöckel

Departamento de Fisiología de la Estabilidad del Rendimiento, Instituto de Ciencias de Cultivos, Universidad de Hohenheim, Fruwirthstr. 21, 70599, Stuttgart, Alemania

Sophie L. Otterbach y Sandra M. Schmöckel

Instituto Max Planck de Fisiología Molecular de Plantas, 14476, Potsdam-Golm, Alemania

Annapurna Devi Allu, Tobias de Werk, Iman Kamranfar, Bernd Mueller-Roeber y Salma Balazadeh

Instituto de Bioquímica y Biología, Universidad de Potsdam, 14476, Potsdam‐Golm, Alemania

Iman Kamranfar y Bernd Mueller-Roeber

Centro de Biología y Biotecnología de Sistemas Vegetales (CPSBB), 139 Ruski Blvd., 4000, Plovdiv, Bulgaria

Bernd Müller-Roeber

Instituto de Biología, Universidad de Leiden, Sylviusweg 72, 2333 BE, Leiden, Países Bajos

salma balazadeh

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SB, BMR, SMS y MT diseñaron la investigación. NOA realizó los experimentos y adquirió los datos experimentales. SLO realizó parte del fenotipado y determinó los niveles de clorofila. NOA, YHW, TDW, SB y SMS realizaron análisis de datos. IK generó la línea de complementación de ataf1–4. Experimentos de qRT-PCR supervisados por ADA. Todos los autores contribuyeron a la interpretación de los datos. SB, BMR y MT adquirieron financiación. NOA, SB y SMS redactaron el manuscrito, que fue finalizado por SB, SMS y BMR. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Salma Balazadeh o Sandra M. Schmöckel.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Alshareef, NO, Otterbach, SL, Allu, AD et al. Los factores de transcripción NAC ATAF1 y ANAC055 afectan la respuesta al estrés por calor en Arabidopsis. Informe científico 12, 11264 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14429-x

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Recibido: 11 mayo 2021

Aceptado: 07 junio 2022

Publicado: 04 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14429-x

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